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丙酮酸羧化酶（PC）檢測試劑盒（微量法 100T/96S）
| 貨號 | SH0446 | 售價(jià)（元） | 1980 |
| 規(guī)格 | 100T/96S | CAS號 |
- 產(chǎn)品簡介
- 相關(guān)產(chǎn)品
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貨號 |
名稱 |
規(guī)格 |
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SH0446 |
丙酮酸羧化酶（PC）檢測試劑盒（微量法 100T/96S） |
100管/96樣 |
測定意義：
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)廣泛存在于動物、霉菌和酵母的線粒體中，催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，是糖異生過程的第一個(gè)限速酶，在保證血糖的動態(tài)平衡方面起著重要的作用。
測定原理：
PC催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD+，在340nm下測定NADH氧化速率，即可反映PC活性。
組成：
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產(chǎn)品名稱 |
SH0446-100T/96S |
Storage |
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提取液 |
100ml |
4℃ |
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試劑一：液體 |
18ml |
4℃ |
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試劑二：液體 |
13μl |
4℃ |
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試劑三：粉劑 |
1支 |
-20℃ |
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試劑四：粉劑 |
1支 |
-20℃ |
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說明書 |
一份 |
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自備儀器和用品：
分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
樣本前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)菌或細(xì)胞，加入1ml提取液，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿600g，4℃離心5min。
3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的PC（此步可選做）。
5、 在步驟④的沉淀中加入1ml提取液，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體PC活性測定。
測定步驟：
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。
工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預(yù)熱5分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑四的配制：在試劑四瓶中加入1mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
2、 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑四和180μL工作液，立即混勻，記錄340nm處初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。
注意：在該試劑盒中，若ΔA大于0.5，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測定，使ΔA小于0.5可提高檢測靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
PC活性計(jì)算：
a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.215×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。
b.用96孔板測定的計(jì)算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.43×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。