當(dāng)前位置： 首頁 - 產(chǎn)品目錄 - 生化試劑盒
線粒體復(fù)合體Ⅴ檢測試劑盒（分光光度法25T/12S）
| 貨號 | SH0260 | 售價（元） | 1584 |
| 規(guī)格 | 25T/12S | CAS號 |
- 產(chǎn)品簡介
- 相關(guān)產(chǎn)品
|
貨號 |
名稱 |
規(guī)格 |
|
SH0260 |
線粒體復(fù)合體Ⅴ檢測試劑盒（分光光度法25T/12S） |
25管/12樣 |
測定意義：
線粒體復(fù)合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶，廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，由F1和F0兩個亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成，也可逆過程水解ATP。此外，復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細菌中。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。
測定原理：
復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi，通過測定Pi增加速率來測定復(fù)合體Ⅴ活性。
試劑的組成和配制
|
產(chǎn)品名稱 |
SH0260-25T/12S |
Storage |
|
試劑一：液體 |
25ml |
-20℃ |
|
試劑二：液體 |
25ml |
-20℃ |
|
試劑三：液體 |
1ml |
-20℃ |
|
試劑四：粉劑 |
1支 |
-20℃ |
|
試劑五：液體 |
6ml |
4℃ |
|
試劑六：粉劑 |
1瓶 |
4℃ |
|
試劑七：粉劑 |
1瓶 |
4℃ |
|
試劑八：粉劑 |
1瓶 |
4℃ |
|
試劑九：液體 |
10ml |
室溫 |
|
說明書 |
一份 |
|
試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前每支加入1.3mL蒸餾水，充分溶解備用，用不完
的試劑仍-20℃保存;
試劑六：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入3mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；
試劑七：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨用前加入10mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；
試劑八：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨用前加入10mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；
定磷試劑的配制：按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染（請根據(jù)需要，用多少配多少）。
注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
需自備的儀器和用品
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
樣本的前處理：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、準確稱取0.1g組織或收集500萬細菌或細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、將勻漿600g，4℃離心5min。
3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ（此步可選做）。
5、步驟4中的沉淀即為線粒體，加入800uL試劑二和8uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅴ酶活性測定。
測定步驟：
1、酶促反應(yīng)
|
試劑名稱（μl） |
對照管 |
測定管 |
|
試劑四 |
25 |
25 |
|
試劑五 |
100 |
100 |
|
樣本 |
|
125 |
混勻， 37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準確水浴30min
|
試劑六 |
50 |
50 |
|
樣本 |
125 |
|
混勻，4000g，25℃離心10min，取上清液
2、定磷
|
上清液 |
170 |
170 |
|
定磷試劑 |
830 |
830 |
混勻，室溫靜置10min左右，在660nm處讀取A測定管和A對照管，計算ΔA=A測定管-A對照管。
復(fù)合體Ⅴ活性計算
標準條件下測定的回歸方程為y = 1.274x + 0.004；x為標準品濃度（mmol/L），y為A值。
1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計算:
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(V樣×Cpr) ÷T
=62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T =50.7× (ΔA-0.004) ÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.101× (ΔA-0.004)
V反總：反應(yīng)體系總體積，3×10-4 L； V樣：加入樣本體積，0.125 mL；V樣總：加入提取液體積，0.808 mL；T：反應(yīng)時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。