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正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

單寧酶全稱是單寧酯酰水解酶(Tannase，EC 3.1.1.20)，它可以水解沒(méi)食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒(méi)食子酸和葡萄糖。

測(cè)定原理：

使用抗氧化劑沒(méi)食子酸丙酯（PG）作為單寧酶酶促反應(yīng)的底物，在270nn下測(cè)定底物PG反應(yīng)前后的光密度變化,計(jì)算單寧酶酶活力。

試劑的組成和配制：

試劑二：粉劑×1支，4℃保存；臨用前每支加入3ml試劑一，充分溶解后備用；用不完的試劑4℃保存；

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml石英比色皿、研缽、冰、蒸餾水

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至270nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表

混勻，40℃準(zhǔn)確保溫10 min后，置95℃水浴中10 min（蓋緊，防止水分散失），冷卻

混勻，270nm處讀取各管吸光值。計(jì)算ΔA=A對(duì)照-A測(cè)定。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)個(gè)一個(gè)對(duì)照管。

注意事項(xiàng)：

可以在不同對(duì)照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集中進(jìn)行5min 95℃沸水浴處理。

TAN活力單位的計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0058x + 0.0044，R2 = 0.9994；x為PG含量（μmol/L），y為吸光值。

1、按樣本體積計(jì)算

單位的定義：40℃下每毫升粗酶液每分鐘水解減少0.01μmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位。

TAN活性(μmol/min/ml)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷V樣÷T

=34.48×( ΔA-0.0044）

2、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：40℃下每毫克蛋白每分鐘水解減少0.01μmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

TAN活性((μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷(V樣×Cpr)÷T

=34.48×(ΔA-0.0044）÷Cpr

3、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：40℃下每克樣品每分鐘水解減少0.01μmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

TAN活性(μmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=34.48×(ΔA-0.0044）÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，1ml； V樣：加入樣本體積，0.05ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，10min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。