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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

AacCas12b 核酸酶(又名 C2c1)是依賴于 RNA 介導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶，在靶標(biāo) DNA 存在 PAM(TTN)的情況下，可特異地剪切靶標(biāo)雙鏈 DNA，使 DNA 雙鏈斷裂并生成粘性末端。而 AacCas12b 特異地剪切單鏈 DNA靶標(biāo)不依賴 PAM 序列。此外，雙鏈或單鏈 DNA 靶標(biāo)均能激活 AacCas12b 的反式剪切活性，即當(dāng)AacCas12b 酶與 sgRNA、靶標(biāo) DNA 結(jié)合形成三元復(fù)合物后，便會(huì)被激活針對(duì)非特異序列 ssDNA 的反式剪切活性，將體系中的任意序列 ssDNA 切碎。

AacCas12b 來(lái)源于嗜酸耐熱菌 Alicyclobacillus acidoterrestris，最佳剪切反應(yīng)溫度為 48℃。AacCas12b依賴于 crRNA 和 tracrRNA(或連接后形成的 sgRNA)引導(dǎo)。此外，AacCas12b 不僅可以應(yīng)用于靶標(biāo) dsDNA的剪切，其針對(duì) ssDNA 的反式剪切活性還可用于靶標(biāo)核酸的快速檢測(cè)，詳見(jiàn)本公司開發(fā)的 HOLMESv2[1]核酸快檢技術(shù)。

產(chǎn)品組分

a. AacCas12b Nuclease 濃度為 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 規(guī)格的總體積為 10 μL，1,000 pmol 規(guī)格的總體積為 100 μL；

b. Control Target DNA and sgRNA 應(yīng)保存于-80℃并避免反復(fù)凍融，必須在 6 個(gè)月內(nèi)使用，使用時(shí)建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應(yīng)體系

保存條件

Control Target DNA and sgRNA 于-80℃儲(chǔ)存，其余組分-20℃儲(chǔ)存；≤ 0℃運(yùn)輸。

活性定義

在總體積為 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反應(yīng)體系中，48℃反應(yīng)條件下，1 min 內(nèi)剪切 1 pmolssDNA 探針?biāo)璧?Cas12b 酶量定義為 1 transU。

例：若某批次 AacCas12b 酶的反式剪切活性為 3.0 transU/pmol，則表明 1 pmol 的該批次 AacCas12b

酶可在 1 min 內(nèi)，在上述指定的反應(yīng)條件下，反式剪切 3 pmol ssDNA 探針。本公司提供的 Cas 酶 transU

數(shù)值詳見(jiàn)各批號(hào)的 COA 檢測(cè)報(bào)告。

實(shí)驗(yàn)流程

1. 順式剪切實(shí)驗(yàn)

c. 順式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。 l

*若用核酸電泳來(lái)分析順式剪切產(chǎn)物，建議使用 dsDNA靶標(biāo)，因?yàn)?ssDNA靶標(biāo)會(huì)被反式激活的 Cas12b 進(jìn)一步切碎。對(duì)于 20 μL 順式 剪切應(yīng)體系，推薦 target DNA的使用量為 100 ng～500 ng，且 target DNA片段長(zhǎng)度在 300 bp～3 kb 范圍內(nèi)。不同長(zhǎng)度 target DNA需要 的 Cas 酶和 sgRNA的量需要根據(jù) target DNA的摩爾量計(jì)算，建議保持 Cas 酶:sgRNA:target DNA的摩爾比為 10:10:1，以盡量確保 target DNA被剪切完全。

48℃反應(yīng) 30 min~1 h，85℃滅活 5 min，核酸電泳分析順式剪切產(chǎn)物。

2. 反式剪切實(shí)驗(yàn)

d. 反式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。 l

*反式剪切體系中各組分的用量可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行調(diào)整，用量較少時(shí)可先將各組分稀釋后加入體系，AacCas12b Nuclease 可用 1×HOLMES Buf er1 稀釋，稀釋后需立即使用（若要稀釋后的 Cas12 酶長(zhǎng)期保存，請(qǐng)使用 Cas12 Dilution Buf er，#32012），sgRNA、 Target DNA 及 ssDNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀釋，但極低濃度的 Target DNA（例如 LOD 實(shí)驗(yàn)）建議用 0.1% Tween 20 稀釋 并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。 l

*反式剪切體系中探針的用量和預(yù)期反應(yīng)到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間可參考各批號(hào)Cas 酶transU的具體數(shù)值，詳見(jiàn)本公司提供的 COA檢測(cè)報(bào)告。

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀檢測(cè)熒光信號(hào)，48℃反應(yīng)，每 30 sec 采集一次熒光信號(hào)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注意事項(xiàng)

1. Cas12b 的順式剪切(cis-cleavage)：Cas12b 在 sgRNA 的引導(dǎo)下，特異性地剪切 target DNA。dsDNA 靶標(biāo)需帶有 PAM 位點(diǎn)，而 ssDNA 靶標(biāo)不依賴 PAM 位點(diǎn)。

2. Cas12b 的反式剪切(trans-cleavage)：當(dāng) target DNA 存在時(shí)，Cas12b/sgRNA 與 target DNA 形成三元復(fù)合物(Cas12b/sgRNA/target DNA)，同時(shí)，Cas12b 被激發(fā)反式剪切活性，將反應(yīng)系中任意序列的單鏈 DNA切碎。

3. 利用本產(chǎn)品的反式剪切活性進(jìn)行分子診斷實(shí)驗(yàn)，可參考本公司的 HOLMESv2[1]體系。

4. 為防止 RNase 污染，請(qǐng)保持實(shí)驗(yàn)區(qū)干凈整潔，操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩，實(shí)驗(yàn)用槍頭、離心管等耗材均為 RNase-free。

5. AacCas12b 酶對(duì)熱敏感，容易失活，應(yīng)全程冰上配置反應(yīng)體系，并在使用后立即將酶置于-20℃保存。

6. 本產(chǎn)品僅供科研使用。

參考文獻(xiàn)

[1] Li L, Li S, Wu N, et al. HOLMESv2: A CRISPR-Cas12b-Assisted Platform for Nucleic Acid Detection andDNA Methylation Quantitation[J]. ACS Synthetic Biology. 2019, 8(10): 2228-2237.